Ja, es wird gemacht. Sie können alle diese hochauflösenden Prozesse in Einklang bringen. Das ist sicherlich sinnvoll, aber eines ist zu beachten: Kryo-EM-Bilder von biomolekularen Komplexen sind zwar hochauflösend, aber schön. Nur: Das sind meist Durchschnittswerte. Denn bei Kryo-EM betrachtet man Elektronendichten. Aber wenn ich die vom Elektronenmikroskop kommenden Elektronen auf das Protein streue, bekomme ich ein extrem verrauschtes Bild. Experten nehmen also etwa 500 bis 1.000 Bilder auf, interpolieren sie, mitteln die Werte und berechnen die genauen Positionen der Atome. Und hier sieht man die Grenzen der Kryo-EM: Die biologische Realität ist meistens nicht so regelmäßig, wie es die Kryo-EM normalerweise suggeriert.
Stellen Sie sich vor, Sie müssten einem Außerirdischen erklären, wie Menschen auf der Erde aussehen. Man könnte 1000 Fotos von Frauen machen, sie mitteln und sagen: Das ist eine Frau. In Wirklichkeit wird jedoch keiner von ihnen so aussehen. Als der Außerirdische auf die Straße kommt, sagt er: Moment mal, alle Frauen sehen anders aus. Genauso verhält es sich mit der Kryo-EM.
“Wir sehen eine gewisse biologische Vielfalt, wir erkennen, dass nicht alle im Detail gleich aussehen”
Aber ergänzen sich Technologien nicht genau dort?
Natürlich ergänzen sie sich gegenseitig. Das sehen wir zum Beispiel an den Kernporenkomplexen, an denen wir gearbeitet haben. Wenn wir uns solche mit Fluoreszenz ansehen, hatten wir nie die Präzision und Auflösung von Kryo-EM im Sinn. Dort liegt die Auflösung tatsächlich im Angström-Bereich. Aber wir sehen hier eine gewisse biologische Vielfalt, wir erkennen, dass nicht alle im Detail gleich aussehen.
Welcher Erfolg wäre Ihr nächstes persönliches Highlight?
Schaut man sich MINFLUX oder MINSTED an, fällt sofort die hohe Auflösung ins Auge. Jetzt haben Sie es geschafft; mit der Lokalisierung fluoreszierender Moleküle hat es wohl nichts mehr zu tun.
Aber es gibt etwas, das wirklich spannend ist und wo ich riesiges Potenzial sehe: die Dynamik von Molekülen, also wie sie ihre Position im Raum verändern. Wenn ein Fluorophor an ein Protein gebunden ist, kann MINFLUX besser erkennen, wie der Fluorophor „wackelt“ oder sich bewegt, als jede andere Methode. Das heißt, wenn der Fluorophor an etwas klebt, dann sehe ich die kleinste Verschiebung im Raum, die kleinste Bewegung in kurzer Zeit, 100-mal schneller als mit einer Kamera. Dies ist ein entscheidender Faktor, wenn es darum geht, die Bewegung oder Konformationsänderung von Biomolekülen zu erkennen, an die ein Fluorophor gebunden ist.
Was ist das Problem mit der Kamera?
Bis heute funktioniert das so: Moleküle heften sich zum Beispiel an ein Protein, um zu sehen, wie sich das Protein bewegt. Dann wird die Zelle oder Teile davon mit einer Kamera aufgenommen und die Bewegung des Farbstoffs verfolgt. Der Farbstoff hinterlässt einen Beugungsfleck aus emittiertem Fluoreszenzlicht auf der Kamera. Dasselbe gilt für PALM/STORM. Dann berechnet man das Zentrum – also den Schwerpunkt – des Beugungsflecks und sagt: Hier war der Farbstoff. Bei diesem Verfahren benötige ich sehr viele Fluoreszenzemissionen pro Zeit. Sonst kann ich den Schwerpunkt nicht genau berechnen. Und deshalb ist dieser Prozess relativ langsam – und derzeit der einzige, der richtig umgesetzt wird.
Solche Techniken wurden zum Beispiel verwendet, um die Schritte von Kinesin auf Mikrotubuli zu messen. Sie konnten sehen, dass sich sein Schwerpunkt in Schritten von acht Nanometern bewegte. Dafür war es allerdings notwendig, den Prozess künstlich zu verlangsamen, sodass nur noch ein Schritt alle Drittelsekunde stattfindet. Aber Proteine bewegen sich nicht so langsam, sonst könnten wir nicht leben. Das bedeutet, dass die ATP-Konzentration massiv reduziert wurde, weil der Lokalisierungsprozess sonst einfach nicht mithalten konnte.
Die direkte Messung der Dynamik ist das Vorrecht der Lichtmikroskopie
Aber jetzt haben Sie gezeigt, dass es auch in Echtzeit geht.
Wenn ich Bewegungen in einer lebenden Zelle oder in einem künstlichen System untersuchen möchte, kann ich mit MINFLUX die Bewegung von fluoreszierenden Molekülen, die an etwas befestigt sind, 100-mal schneller sehen – mit der gleichen Präzision. Oder umgekehrt, Langsamkeit akzeptieren, aber viel genauer messen. Und andererseits kommt möglicherweise Ångstrom ins Spiel, denn es kann durchaus eine Rolle spielen, ob sich der Fluorophor mit 8,2 oder 8,4 Nanometern bewegt. Es geht nicht um die Auflösung, sondern darum, wie genau ich Bewegungen oder Konformationsänderungen messe. Auch die Elektronenmikroskopie kann das nicht, weil dort die Probe eingefroren und im Vakuum ist. Die direkte Messung der Dynamik ist das Vorrecht der Lichtmikroskopie.
Heißt das, Sie fangen gerade erst an?
Wir haben ein weites Feld vor uns. Es ist noch sehr früh, aber in fünf bis zehn Jahren könnte STED beispielsweise in der pharmazeutischen Entwicklung helfen. Denn es gibt mir die Möglichkeit, die Dynamik genau zu beobachten – zum Beispiel genau zu untersuchen, wie zwei Moleküle zusammenkommen. Ich könnte zum Beispiel einen Wirkstoff markieren und messen, wie sich die Dynamik des Proteins unter dem Einfluss dieses bestimmten Wirkstoffs verändert. Ich sehe viel Potenzial in der pharmazeutischen Entwicklung, und es ist noch ungenutzt. Du denkst nicht einmal darüber nach.
Jenseits der Beugungsgrenze
Um Strukturen in lebenden Organismen sichtbar zu machen, arbeitet die Biologie mit fluoreszierenden Markern: Farbstoffen, die an bestimmte Strukturen in der Zelle binden und bei Anregung mit Licht einer bestimmten Wellenlänge leuchten.
Eine natürliche Grenze begrenzt die Auflösung solcher Bilder: Aufgrund der Lichtbeugung ist es nicht mehr möglich, zwei Objekte getrennt wahrzunehmen, die näher beieinander liegen als etwa die halbe Wellenlänge des emittierten Lichts. Da sichtbares Licht eine Wellenlänge zwischen 400 und 700 Nanometer hat, liegt die Grenze bei etwa 200 bis 300 Nanometer. Seit den 1990er Jahren haben Wissenschaftler Methoden entwickelt, um diese natürliche Auflösungsgrenze zu umgehen. Sie alle haben eines gemeinsam: Sie sorgen durch An- und Abschalten der Fluoreszenz dafür, dass immer nur wenige Moleküle aufleuchten.
STED
Die von Stefan Hell entwickelte Technik basiert auf der Verhinderung von Fluoreszenz durch stimulierte Emission. Wie in der klassischen Mikroskopie regt ein Laserstrahl fluoreszierende Moleküle in einem bestimmten Bereich zum Leuchten an. Ein weiterer “kegelförmiger” Laserstrahl entfernt durch stimulierte Emission die Fluoreszenzfähigkeit aller Moleküle – außer denen, die sich in einem sehr kleinen Bereich in der Mitte des “Kegels” befinden. Je kleiner dieser Bereich um den Nullpunkt des STED-Lasers ist, desto weniger Moleküle können gleichzeitig aufleuchten und desto schärfer wird das Bild. Mit dieser Kombination aus Ein- und Aus-Strahlen wird die Probe systematisch abgetastet.
PALME/STURM
Dabei sind die fluoreszierenden Moleküle zunächst ausgeschaltet – also in einen Zustand, in dem sie nach Bestrahlung mit Anregungslicht nicht fluoreszieren können. Beim Einschalten der Probe wird diese zunächst mit einem so schwachen Schaltlicht beleuchtet, dass statistisch höchstens ein Molekül innerhalb der Beugungsgrenze von 200 bis 300 Nanometer räumlich völlig zufällig eingeschaltet wird. Mit Hilfe des Beugungsmusters, das durch die Fluoreszenz der einzelnen Moleküle auf der Kamera entsteht, wird dann die zunächst unbekannte Position der aktivierten Moleküle bestimmt. Das Maximum (oder “Schwerpunkt”) des Beugungsmusters ist gleich der Position des Moleküls, das nach unten in die Fokusebene projiziert wird. Dies wird als „Lokalisierung“ bezeichnet. Dann werden die registrierten und lokalisierten Moleküle ausgeschaltet und eine Runde neuer Moleküle eingeschaltet.
Dieses als PALM (Photoaktivierungs-Lokalisationsmikroskopie) oder STORM (stochastische optische Rekonstruktionsmikroskopie) bekannte Verfahren verwendet fluoreszierende Moleküle, die aktiv oder spontan ein- und ausgeschaltet werden können („Blinken“). Während das sequentielle Ein- und Ausschalten einzelner Moleküle ihre Trennung ermöglicht, enthüllt das Auffinden des Zentrums ihres Beugungsmusters ihre Position. Wendet man diese auf (fast) alle Moleküle in der Probe an, erhält man ein scharf aufgelöstes Bild. Die Auflösung ist vergleichbar mit dem STED-Bild.
MINFLUX
Minflux kombiniert Elemente aus dem STED-Prozess und stochastischen Ansätzen. Wie in PALM/STORM werden Moleküle verwendet, die wiederholt ein- und ausgeschaltet werden können. Erstens wird statistisch höchstens ein fluoreszierendes Molekül pro diffraktiver Oberfläche aktiviert, also in einen Zustand versetzt, in dem es bei Beleuchtung mit Anregungslicht fluoreszieren kann. Entscheidend ist, dass ein Anregungsstrahl mit einem Nullpunkt in der Mitte – wieder ein kegelförmiger Laser wie bei STED, aber diesmal zur Anregung – die Probe Stück für Stück abtastet. Die Position des Donuts und damit der Nullpunkt des Donuts kann mit einer Genauigkeit von weniger als einem Nanometer kontrolliert werden, ist also immer genau bekannt.
Befindet sich der Fluorophor genau im Zentrum des Anregungsstrahls, bleibt das Molekül dunkel, weil dort die Intensität des Anregungsstrahls Null ist. In diesem Fall wurde die Position des fluoreszierenden Moleküls mit großer Genauigkeit gefunden; sie muss mit der genau bekannten Nullstellung des Kegels identisch sein. Liegt der Nullpunkt aber direkt neben dem Molekül, leuchtet es schwach. Da die Intensität des Anregungslasers zum Ring des Donuts hin zunimmt, verrät die Anzahl der emittierten Photonen den Abstand des Moleküls zum Nullpunkt und damit die Position des Moleküls: Je dunkler es leuchtet, desto näher sind sie beieinander . Beim MINFLUX-Verfahren tastet ein kegelförmiger Anregungsstrahl die Probe Stück für Stück ab und optimiert sie mit Laserleistung auf minimale Fluoreszenz. Je besser es gelingt, den Nullpunkt mit einem Molekül räumlich zu überlappen, desto genauer kann seine Position bestimmt werden. Auf diese Weise erhalten Wissenschaftler hochgenaue molekulare Positionen. In Verbindung mit dem sequentiellen An- und Abschalten aller Fluorophore erreichen die Bilder eine Auflösung von 1 bis 3 Nanometern, also der Größe eines Moleküls.
GEPRÜFT
Minsted kombiniert zudem die Stärken der Einzelmolekülmikroskopie mit der präzisen Lokalisierung der STED-Methode. Im Gegensatz zu Minflux wird jedoch sowohl ein Einschalt- als auch ein Ausschaltlaser (STED) verwendet. Auch hier kommen schaltbare fluoreszierende Moleküle zum Einsatz. Zunächst wird durch Zufallsschaltung ein Molekül pro Auflösungsgrenze aktiviert. Das Abtasten von Proben funktioniert auf die gleiche Weise wie Minflux, jedoch mit einem Laseraufbau wie STED – einem Anregungsstrahl und einem kegelförmigen Abschneidestrahl. Die Intensität des fluoreszierenden Moleküls ist also am größten, wenn der Mittelpunkt des Kegels direkt darüber liegt. Da der Zusammenhang zwischen dem Abstand vom Nullpunkt und der Intensität bekannt ist, basiert auch hier die Lokalisierung auf diesem Zusammenhang. Mit MINSTED lassen sich Lichtmoleküle nun auf wenige Angström, also Zehntel Nanometer, lokalisieren.
